Onderzoekers vinden mechanisme dat gene editing met CRISPR-Cas9 verstoort

Met de ontdekking van CRISPR-Cas9 is gene editing heel eenvoudig geworden. Helaas is sinds kort bekend dat het moleculaire gereedschap niet zo precies is als gedacht, en dat het ongewenste mutaties in het DNA van een cel kan veroorzaken. Onderzoekers van de TU Delft hebben nu een mechanisme geïdentificeerd dat dergelijke mutaties veroorzaakt wanneer CRISPR-Cas9 op een verkeerde manier wordt ingezet. Inactieve genen kunnen hierbij tot uitdrukking komen, wat erg gevaarlijk kan zijn. De onderzoekers hebben op basis van hun bevindingen een checklist gemaakt. Die helpt voorkomen dat het schadelijke mechanisme geactiveerd wordt en maakt genoombewerking met CRISPR-Cas9 veiliger.

Net als die van veel andere organismen bevatten menselijke cellen twee exemplaren van elk chromosoom: één van elke ouder. Deze chromosoomkopieën zijn bijna identiek, maar ze bevatten kleine verschillen in een aantal genen. Die kleine variaties leiden tot de genetische verschillen tussen individuen. Het klinkt misschien als een goede zaak dat elk chromosoom een soort ‘back-up’ heeft, maar onderzoekers van de TU Delft hebben vastgesteld dat dit problemen kan veroorzaken in combinatie met de genoombewerkingstechniek CRISPR-Cas9. “Wanneer met CRISPR-Cas9 een enkel chromosoom in heterozygote organismen zoals de mens wordt aangepast, wordt er een natuurlijk herstelmechanisme geactiveerd”, vertelt onderzoeker dr. Jean-Marc Daran. “Het blijkt dat dit mechanisme de andere kopie van het chromosoom gebruikt als sjabloon voor het repareren van het DNA.”

Genoom wijzigen
Normaal gesproken kunnen genoombewerkingsdeskundigen met CRISPR-Cas9 een deel van het genoom van een cel wijzigen door een nieuwe DNA-sequentie te introduceren. Het Cas-eiwit knipt het DNA open op een vooraf bepaalde plek, waarna men verwacht dat de cel zijn opengeknipte DNA repareert met behulp van deze nieuwe streng genetisch materiaal. Op die manier kunnen nieuwe genen in het DNA worden geplakt. “Maar wanneer het reparatiemechanisme het andere chromosoom als sjabloon gebruikt in plaats van de nieuwe DNA-streng, lukt de bewerking natuurlijk niet”, zegt Daran. Reparatie met behulp van het andere chromosoom is veel efficiënter, waardoor reparatie met behulp van het beoogde DNA-fragment bijna nooit voorkomt. Erger nog, er kan verlies van heterozygositeit optreden, wat ernstige gevolgen voor de gezondheid kan hebben. Ziektegenen die inactief waren kunnen tot expressie komen, zoals genen die kanker veroorzaken.

Toevallige ontdekking
De Delftse onderzoekers ontdekten het mechanisme bij toeval. Arthur Gorter de Vries, promovendus aan de TU Delft, probeerde vast te stellen hoe domesticatie van biergist uiteindelijk leidde tot de moderne gistsoorten die bierbrouwers nu gebruiken. “Ik probeerde een bepaald gen te verwijderen om de functie ervan te bepalen”, vertelt Gorter de Vries. “Vreemd genoeg kon ik niet bevestigen dat ik het gen had weten te verwijderen. Ook merkte ik dat de cellen zich vreemd gedroegen.” Gorter de Vries had slechts één van de chromosomen in zijn gist genetisch bewerkt. Verdere experimenten toonden aan dat de gistcellen de andere kopie van het chromosoom als sjabloon gebruikten om hun DNA te repareren; het DNA dat hij juist probeerde te verwijderen.

Schadelijke mutaties
Dit nieuw ontdekte mechanisme kan ervoor zorgen dat genoombewerking mislukt, en kan zelfs tot schadelijke mutaties leiden. Dit gebeurt echter wel alleen in heterozygote organismen. “Het is daarnaast belangrijk om te benadrukken dat het reparatiemechanisme alleen actief wordt als men zich op slechts één chromosoom richt bij de bewerking, en niet op allebei”, zegt Daran.

Naast dit reparatiemechanisme zijn er nog andere factoren om rekening mee te houden bij gene editing in heterozygote organismen. De onderzoekers hebben daarom een checklist opgesteld om op een veilig manier het DNA van deze organismen te bewerken. De resultaten van hun onderzoek, inclusief de checklist, zijn gepubliceerd in Nucleic Acids Research.

****

Gorter de Vries, A.R., Couwenberg, L.G.F., van den Broek, M., de la Torre Cortés, P., ter Horst, J., Pronk J.T. and Daran, J-M.G. Allele-specific genome editing using CRISPR–Cas9 is associated with loss of heterozygosity in diploid yeast. Nucleic Acids Res.,

DOI: 10.1093/nar/gky1216

Arthur Gorter de Vries
A.R.gorterdevries@tudelft.nl
06 – 37 22 62 04

Dr. Jean-Marc Daran
J.G.Daran@tudelft.nl
0031 (0)15 27 82412

(Credit beeld: Getty Images)